前言
关于bulk-seq分析，你是使用fpkm？还是tpm?
这个问题，可能对于初学者来说，很是纠结。因为，你在文章中有使用fpkm，也有使用tpm？也有使用count？我们在“一文了解Count、FPKM、RPKM、TPM”推文中也详细介绍了各参数的表示的意义。以及在关于Count，FPKM，TPM，RPKM等表达量的计算及转换中也介绍了它们之间的转换。
但是，**学习的一直是在不断向前，以及不断纠错的过程。**我们每个人都在经历此过程。
bulk-seq分析中，是什么标准进行后续的分析呢？
对于这个问题，我们“社群”也有在讨论过？也有很多同学在咨询这个问题。有同学认为FPKM并不是很准确，推荐使用tpm值。但是也有同学一直在使用FPKM值，或是其它值进行筛选，如count（最原始的表达量），RPM等。
对于，最生信的同学来说，无论是count，FPKM、TPM等值，都只是一个数字，仅仅只是一个数字，“不能表示任何意义”，我们只需要整体的趋势一样即。因此，无论是使用fpkm，或是tpm，都可以满足我们的需求。
但是，使用不同的表达量，最大的区别在于筛选的基因数量，这个是无法避免的。
FPKM
FPKM: FPKM的全称为Fragments Per Kilobase Million，Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)。通俗讲，把比对到的某个基因的Fragment数目，除以基因的长度，其比值再除以所有基因的总长度。注意，这里的基因长度是指基因外显子的总长度。
RPKM
**RPKM: **Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)；
RPM
RPM: RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads)
公式：RPM = ExonMappedReads * 10^6 /TotalMappedReads
TPM
**TPM：**TPM的全称为Transcripts per million，Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)
转换或计算
我们都知道，无论是fpkm，tpm，rpm值都是基于每个基因的count值与Gene Length进行计算。
计算的方法也很多，但是或出现：使用不同的计算方式，得到的结果并不一致。
这个问题，大家也会经常遇到，包括我自己。到这一步，就会很纠结，也会质疑自己，然后会“卡”很久。
木知，大家知否是这样的？
Code
我们也基于前期分享，在分享使用Count转换FPKM或是TPM值的代码。
我们的代码仅提供给大家参考。
Count To FPKM
- R语言Code
##'@计算FPKM
data <- read.table("./01.cucumber.mRNA.gene.count.txt",header = T, sep = "\t", row.names = 1)
head(data)
gene_length_kb <- data$Length /1000
expression_matrix <- data[, 2:ncol(data)]
head(expression_matrix)
# # 计算每列总Counts
total_counts <- colSums(expression_matrix)# 计算FPKM值
fpkm_matrix <- sweep(expression_matrix, 2, total_counts / 1e6, "/") # 除以总Reads
fpkm_matrix <- sweep(fpkm_matrix, 1, gene_length_kb, "/") # 除以基因长度
fpkm_matrix[1:5,1:10]
输入数据
- perl脚本
use strict;open A,"$ARGV[0]";<A>;
my @colsum;
while(<A>){chomp;my @line=split;shift @line;shift @line;for(0..$#line){$colsum[$_]+=$line[$_];}
}open B,"$ARGV[0]";
my $head=<B>;
chomp($head);
print "$head\n";
while(<B>){chomp;my @line=split;my $gene=shift @line;my $length=shift @line;print "$gene\t";for(my $i=0;$i<@line;$i++){my $fpkm=$line[$i]*1000000*1000/($colsum[$i]*$length);print "$fpkm\t";}print "\n";
}
运行
perl CountToFPKM.pl Input_count.txt > OutPut_FPKM.txt
Count To TPM
##'@使用count计算tpm
count_df <- read.table("./01.cucumber.mRNA.gene.count.txt",header = T, sep = "\t", row.names = 1)
head(count_df)# TPM函数
calculate_tpm <- function(counts, lengths) {rpk <- counts / (lengths / 1000) # RPK: count per kilobasescaling_factors <- colSums(rpk) / 1e6 # per million scaling factortpm <- sweep(rpk, 2, scaling_factors, "/") # divide each column by its scaling factorreturn(tpm)
}# 准备数据
gene_lengths <- count_df$Length
count_matrix <- as.matrix(count_df[, -1]) # 排除长度列，仅保留 count 数据# 计算 TPM
tpm_matrix <- calculate_tpm(count_matrix, gene_lengths)# 查看结果
tpm_matrix[1:5,1:10]
关于Count值，直接使用featureCounts等软件即可获得。
OK，以上仅是自己的学习笔记，若是有不对的地方，请大家指出。
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