前言：
蛋白互作网络，即Protein–protein interaction(PPI) network，是描述一组蛋白间相互作用关系的分析方式。因为蛋白间的相互作用关系复杂，每一个蛋白都是一个节点，多个蛋白间的相互作用连成线条就形成了网状结构，故称之为蛋白互作网络。
分析蛋白互作网络的目的是什么呢？主要有两点：一方面自然是帮助我们明确蛋白之间的相互作用关系，这一点对于一些IP-MS研究很重要；另一方面，我们还能筛选出一些处于蛋白互作网络上关键节点的蛋白，这对于生物标志物的筛选具有指导意义。
今天小谱将通过一个实例向大家展示蛋白互作网络是如何绘制的，为了达到类似文章中的较为美观的效果，我们需要用到STRING数据库和Cytoscape软件这两个工具。
分析的起点是一组蛋白（名称或者ID号），它们可以来源于我们蛋白IP-MS筛选出来的所有互作蛋白，也可以是我们差异分析所筛选出来的全部差异表达蛋白，通常50-300个蛋白可以获得较好的图形展示效果。
操作过程如图1所示：将待分析的蛋白列表（从Multiple proteins界面直接粘贴蛋白ID，也可以通过文件上传）导入STRING数据库（一个进行蛋白互作分析的专业数据库，网址为：https://cn.string-db.org/）。选择样品的物种来源，人源对应Homo sapiens，最后点击SEARCH。
图 1 STRING数据库搜索界面
搜索之后会转到一个总结界面（图2），这是对我们上一步导入的蛋白信息的一个反馈，这里要稍微注意一下它反馈的蛋白数目（如红框所示，如果数目对不上可能是出现了重名或匹配不上的情况）。点击CONTINUE，我们就能得到一个初步的蛋白互作网络（图3）。
图 2 输入蛋白条目总结
图 3 STRING数据库生成的PPI互作网络
蛋白互作网络下面是设置界面（图4），其中的选项和功能包括：
Viewers：数据展示
Legend：网络中的线条和节点的释义
Settings：对蛋白互作网络进行设置
Analysis：对蛋白互作网络的数据统计和功能富集分析
Exports：导出蛋白互作网络图片或者文本信息
Cluster：对蛋白互作网络进行分簇
More/Less：扩大或者缩小网络范围
在Setting区域可以调整蛋白相互作用评分的范围，以获得不同可信程度的蛋白互作网络。此外也可以对蛋白相互作用的类型、数据来源等进行设置。
图4 STRING互作网络的设置
在Clusters区域可以通过不同算法对相互作用蛋白进行分簇，将互作网络划分为规定数量的不同聚类。（图5）
图 5 STRING互作网络的聚类
在Exports区域可以导出不同格式的互作网络分析结果。通常可下载蛋白互作TSV文件（list only one-way edges :A-B）进行后续美化和分析。
图 6 STRING互作网络的导出
1）蛋白互作信息导入和互作网络生成
下载安装Cytoscape软件，网址：https://cytoscape.org/。在Cytoscape主界面的file – import - Network from files中导入从STRING中下载的蛋白互作网络文件，窗口弹出后点击OK就能在软件界面的右上角出现蛋白互作网络（图7）。
图 7 导入蛋白互作网络
2）其他相关定性定量数据导入
点击file – import - Table from files导入蛋白定性定量数据（如差异分析时的差异倍数和p值），第一列为蛋白基因名（需要与导入的互作网络文件中的名称保持一致），成功导入后，下方的Table Panel中会出现导入的信息列（图8）。
图 8 导入蛋白定性定量数据
3）节点大小颜色调整和设置
点击左栏1处Style可以对互作网络进行调整，点击2处style可以选择软件自带的不同网络风格，3处可以对网络细节进行调整。Node是蛋白节点，节点的形状、大小、颜色和文字等均可以调整（图9）。于4处锁定节点纵横比后，可以在Size处调整节点大小（黄色方框处），在Size栏下的Column选择数据来源如差异倍数（FC）等，就可以根据蛋白表达差异倍数形成相应大小的节点。这一板块的其他设置操作与之类似，Edge部分为节点间的连线设置，Network和Column分别为网络和表格的整体设置。
图 9 节点大小颜色调整和设置
4）功能插件的使用
安装功能插件可以提高Cytoscape的使用体验，添加方式为软件主界面的Apps>App Store，插件下载网站为：https://apps.cytoscape.org/。在这里，给大家介绍三个好用的功能插件：
stringApp：一站式蛋白互作网络构建（图10）
安装stringApp后可以直接在Cytoscape软件中构建蛋白互作网络，而且非常适合构建大型网络。安装软件后可在1处Network直接导入蛋白互作网络，点击2处，选择3处STRING protein quary，在4处导入蛋白ID和物种名，搜索之后即可生成相应的蛋白互作网络图，Apps-STRING还有一些其他功能，包括扩大网络，设置蛋白互作可信度阈值等。同样的，通过STRING生成的蛋白互作网络也可以通过3)部分所描述的方法进行调整。
图 10 STRING 构建蛋白互作网络
MCODE：紧密联系子网络的生成和提取
安装MCODE后可以在1处Apps栏内看到它，点击之后出现一个弹窗，按照默认参数分析当前网络，会在2处框内看到数个子网络图，这个时候可以选择子网络图，点击3处选择From selected Nodes, All Edges，提取子网络（图 11）。也可以在前文3）部分介绍节点设置中将子网络设置不同颜色大小以突出显示。类似具有提取子网络图功能的插件还有cytohubba，它可以通过不同算法对互作蛋白进行评分和排序，进而选择其中的关键蛋白构建子网络图。
图 11 MCODE子网络的生成和提取
yFiles Layout Algorithms：网络输出模式选择
当不需要对网络模式做调整，默认如图12所示的基础输出模式时，我们可以点击网络图中的一些偏离节点，移动它们来调整网络布局。顶部的Layout菜单栏中也有几个简单的网络模式可供选择。安装yFiles Layout Algorithms App后在Layout中会出现多种网络模式图设置（黄色方框内），直接点击就可以转换成相应的网络模式效果，部分效果展示如图13所示。
图 12 网络风格设置及细节调整界面
图 13 不同风格及网络输出形式展示
以上3个是Cytoscape最常用的插件，篇幅受限，还有一些推荐的插件没有办法详细介绍，大家可以自行尝试，例如GlueGO/BinGO插件可以在网络图中进行功能聚类富集分析，Wikipathway可以分析绘制蛋白信号通路图。
完成蛋白互作网络的构建和美化后，选择File-Export-Network to Image，就可以导出蛋白互作网络图片啦。
我们对今天的分享内容做一下总结，STRING数据库分析结合Cytoscape绘图是当下进行蛋白互作网络分析所使用的主流方法，对于PPI网络的美化及进阶处理可以多借助一些插件，细节部分则可以根据个人喜好进行调整，最后就能做出既美观又高端的蛋白互作网络图啦。
这就是今天我们介绍的蛋白互作网络分析构建的全部内容。欢迎大家关注我们，下一期我们会给大家详细介绍如何预测与分析蛋白相互作用结构域，期待一下吧！