大家好！今天来了解一项在三维水凝胶表面生长金纳米星的研究——《Growing Gold Nanostars on 3D Hydrogel Surfaces》发表于《Chemistry of Materials》。水凝胶在生物医学等诸多领域有着重要应用，而金纳米星具有独特的光学性质。这项研究通过原位合成的方法，将二者结合，不仅克服了传统制备方法的诸多难题，还展示了在SERS传感和成像等方面的潜在应用价值，为新型生物材料的开发提供了新的思路和方法。
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一、研究背景
（一）等离子体金属纳米粒子的应用及制备方法
等离子体金属纳米粒子在生物医学领域有广泛应用，如传感器、热等离子体治疗、成像剂、药物载体和诊断工具等。其制备方法包括自上而下和自下而上两种。自上而下的方法能提供高空间精度，但所得等离子体结构质量可能较低，且某些条件可能与底物材料不兼容。自下而上的合成化学是制备具有特定物理、化学和生物性质的纳米结构的可靠且可控的方法，能精确合成多种各向异性胶体纳米粒子，但将胶体纳米粒子结合到基底或设备上通常需要复杂的多步骤过程，且在具有复杂3D特征的基底上创建等离子体纳米粒子涂层具有挑战性。
（二）原位生长技术的优势与局限
化学“原位生长”是一种新兴的合成技术，纳米粒子通过金属盐的自下而上化学还原直接在另一种材料表面形成。这种方法结合了自下而上化学合成方法的优点，避免了冗长的自组装步骤。然而，原位生长在软聚合物和水凝胶等材料上的研究较少。
（三）水凝胶与等离子体纳米粒子结合的意义及现有方法的问题
水凝胶与等离子体纳米粒子的结合对于组织工程、光热平台和表面增强拉曼散射（SERS）生物成像和传感等领域具有重要意义。常见的制备水凝胶纳米复合材料的方法包括将胶体纳米粒子与未固化的水凝胶聚合物混合以及通过紫外线光照射金属前体诱导纳米粒子生长，但这些方法可能会改变聚合物的物理和化学性质，影响传感应用。
二、实验部分
（一）材料
实验使用的材料包括猪皮明胶、2-羟基-4'-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮、甲基丙烯酸酐、Ⅱ型胶原蛋白酶、I型胶原蛋白、纤连蛋白等多种试剂，以及MDA-MB-231细胞、DMEM等细胞培养相关材料。
（二）GelMA合成
将明胶在PBS溶液中于50°C溶解，加入甲基丙烯酸酐搅拌，然后在45°C透析5天，每天换水两次，最后冻干得到GelMA。制成10%w/w的GelMA水溶液，加入0.5%w/w光引发剂，在70°C溶解后，取约200μL溶液放入直径约1cm的孔中，用UV灯固化30min得到水凝胶。
（三）金纳米粒子合成
1、胶体合成
金种子合成：将15 mL 1%柠檬酸钠溶液加入100mL 1mM HAuCl₄溶液中，在200 mL锥形瓶中剧烈搅拌，然后停止搅拌，关闭加热板，静置15min，冷却后储存于4°C。
柠檬酸封端的AuNSt制备：将5mL Milli-Q水、5μL 1M HCl和25μL 50mM HAuCl₄混合，加入100μL种子，然后同时快速加入30μL 10mM AgNO₃和25μL 100mM抗坏血酸，剧烈搅拌。
功能化：按一定比例加入0.1mM PEG-SH（5000 MW）进行功能化，然后离心、重悬。
2、原位种子介导合成
将基底置于种子溶液中，偶尔手动摇晃，15min后取出，用Milli-Q水冲洗。
以LSB为例，制备含有4mL100mMLSB、60μL50mMHAuCl₄、60μL10mMAgNO₃和40μL1MHCl的生长溶液，加入200μL100mM抗坏血酸搅拌，溶液变清后加入种子水凝胶。
TX的合成过程类似，但试剂用量不同。
3、无种子原位合成
单步合成：将GelMA基底直接加入含有4mLMilli-Q水、60μL50mMHAuCl₄和60μL10mMAgNO₃的溶液中约30s，然后加入100μL100mM抗坏血酸搅拌，5min后取出冲洗。
预负载合成：先将基底在2.5-50mM抗坏血酸水溶液中孵育5min-3h，然后取出冲洗，再放入含有4mL水、60μL50mMHAuCl₄和60μL10mMAgNO₃的生长溶液中，偶尔手动搅拌，5min后取出冲洗。
（四）3D打印GelMA支架和细胞接种
使用3DDiscovery生物打印机打印支架，设置相关参数如纤维间距、流速、压力等，每沉积一层，用365nm光固化，最后用UV灯照射1.5min。对支架进行纤连蛋白/胶原蛋白涂层功能化处理，然后接种MDA-MB-231细胞，通过标准的钙黄绿素-AM/碘化丙啶活/死染色评估细胞活力。
（五）表征
使用多种仪器对水凝胶和纳米粒子进行表征，包括紫外-可见-近红外光电二极管阵列分光光度计、流变仪、核磁共振仪、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、拉曼光谱仪、X射线光电子能谱仪、共聚焦显微镜等。
三、结果与讨论
（一）AuNSt的合成与表征
1、种子介导生长
采用胶体和原位生长的混合策略，将胶体种子附着在预固化的凝胶上，然后原位生长分支。例如，将GelMA基底在柠檬酸封端的纳米球分散液中孵育，然后加入含HAuCl₄和其他试剂的生长溶液。
通过调整反应条件防止二次成核，得到了AuNSt@LSB和AuNSt@TX两种产物，TEM分析确认其具有分支形态，SEM确认AuNSt涂层在水凝胶表面，且两种产物形态和分支相似，但从两种合成方法中均得到了第二种群更大的AuNSt，经分析可能是直接在凝胶上自发成核生长的。
2、无种子原位生长
优化了直接从凝胶中生长AuNSt的方法，无需任何表面活性剂或种子。单步合成得到具有分支形态的产物，但存在二次成核问题，通过UV-可见光谱和TEM表征发现生长溶液中的产物与凝胶上的产物在形态和尺寸分布上不同。预负载合成可提高覆盖率和产率，在25mM抗坏血酸中孵育30min可得到密集的高度分支结构涂层，且这些大尺寸的AuNSt在SERS和其他应用中有优势。
3、生长机制
通过拉曼散射和X射线光电子能谱研究发现Au³⁺与GelMA的天然化学官能团配位，GelMA本身可作为还原剂。例如，当GelMA在HAuCl₄溶液中孵育时，颜色发生变化，拉曼散射测量显示相关特征峰消失或移动，XPS和SEM表征确认了Au⁰的存在和纳米粒子的形成。
（二）AuNSt在凝胶表面的选择性形成
通过SERS信号的空间分布和强度证明原位生长可导致AuNSt在凝胶表面的选择性形成。对于含有标记AuNSt的纳米复合材料，通过不同方法制备的样品SERS信号分布不同，原位制备的样品主要在表面显示4-MBA的特征信号，而含有胶体粒子的纳米复合材料在水凝胶表面粒子较少，SERS信号在整个体积内均匀。
表面定位可提高SERS信号，例如通过种子介导原位生长方法制备的底物，其4-MBA的SERS信号比用预制胶体制备的底物高近2个数量级，单步和预加载原位生长方法制备的底物也有不同程度的提高。
（三）纳米复合材料的性能
1、流变学性能
原位生长制备的AuNSt复合材料的弹性储能模量与天然GelMA更相似，表明原位生长对凝胶的物理性质影响较小，而添加胶体粒子制备的纳米复合材料则不同。
2、生物应用
在3D打印的GelMA支架上制备了AuNSt涂层，并接种了乳腺癌细胞，进行了SERS研究。例如，按照预加载原位生长程序在3D打印的GelMA支架上成功制备了AuNSt涂层，当对支架上的纳米粒子进行功能化后，可获取SERS图谱。还进行了无标记的细胞传感和成像实验，发现细胞在支架上的吸附情况与2D培养有所不同，但细胞活力相似，且从含细胞区域记录的SERS光谱显示出与细胞相关的特征峰。
四、研究结论
展示了在水凝胶基底上原位合成AuNSt的可能性，包括种子介导原位生长和直接原位生长两种方法，可选择性地在聚合物材料表面附近产生密集的AuNSt涂层。
原位生长方法制备的材料SERS信号比基于胶体的材料高，且可用于具有不同几何形状的基底，包括3D特征的复杂基底。
原位生长的纳米复合材料在生物传感和成像等领域有潜在应用，未来可进一步探索提高无表面活性剂生长的产率和均匀性，以及在不同含肽聚合物上的原位AuNSt生长。
五、一起来做做题吧
1、等离子体金属纳米粒子在生物医学领域有多种应用，以下不包括的是（ ）
A. 传感器
B. 建筑材料
C. 成像剂
D. 药物载体
2、GelMA 合成过程中，透析是在什么温度下进行的？（ ）
A. 30°C
B. 45°C
C. 50°C
D. 60°C
3、在金纳米粒子的胶体合成中，制备柠檬酸封端的 AuNSt 时，加入种子后紧接着需要同时快速加入的试剂不包括（ ）
A. 30 μL 10 mM AgNO₃
B. 25 μL 100 mM 抗坏血酸
C. 5 μL 1M HCl
D. 无正确答案，以上试剂均需加入
4、在种子介导生长 AuNSt 的过程中，为防止二次成核，对于 AuNSt@LSB，采用的方法是（ ）
A. 加快反应速度
B. 增加抗坏血酸的量
C. 通过添加 HCl 减慢反应
D. 更换种子类型
5、无种子原位合成中，预负载合成可提高 AuNSt 的覆盖率和产率，在以下哪种条件下可得到密集的高度分支结构涂层？（ ）
A. 在 2.5 mM 抗坏血酸中孵育 5 min
B. 在 25 mM 抗坏血酸中孵育 30 min
C. 在 50 mM 抗坏血酸中孵育 1 h
D. 在 30 mM 抗坏血酸中孵育 2 h
6、原位生长方法制备的材料相比基于胶体的材料，在 SERS 信号方面（ ）
A. 低很多
B. 无明显差异
C. 高很多
D. 无法比较
参考文献：
Vinnacombe-Willson GA, et al. Growing Gold Nanostars on 3D Hydrogel Surfaces. Chem Mater. 2024 May 6;36(10):5192-5203.